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工程化酿酒酵母高效合成香紫苏醇的研究

申报人：潘新元 申报日期：2024-11-08

基本情况

2025年度大学生创新创业训练计划
工程化酿酒酵母高效合成香紫苏醇的研究 学生选题
创新训练项目
工学
生物工程类
教师科研项目选题
一年半期
该项目为企业委托项目。该项目的主要内容是针对角鲨烯与香紫苏醇等高值萜烯天然产物，开发能高效异源合成的微生物细胞工厂。本课题为该项目的一部分，重点针对香紫苏醇的高产微生物细胞工厂进行设计、构建和优化开发。
无
承担重点研发计划课题等多项课题。

对本项目的开展提供力所能力的各种支持，包括但不限于实验条件、经费和指导工作。

校级

项目成员

序号 学生 所属学院 专业 年级 项目中的分工 成员类型
潘新元 药学院 制药工程 2022 组织开展实验，负责汇报答辩
高文卓 生物工程学院 083600/生物工程 2022 参与开展实验
张恺 药学院 制药工程 2022 参与实验
周德勤 药学院 制药工程 2022 参与实验

指导教师

序号 教师姓名 教师账号 所属学院 是否企业导师 教师类型
王风清 07430 生物工程学院 否

立项依据

通过人工生物合成技术实现香紫苏醇的廉价生产，基于已设计的香紫苏醇人工生物合成路线，本项目将主要达成三个工作目标：

1）筛选和优化人工途径中的关键酶


2) 实现香紫苏醇人工生物合成路线的优化集成


3) 通过各个酶反应模块的有效组合实现香紫苏醇的微生物全合成，且总收率不低于 10%。

以酿酒酵母为出发菌株，利用合成生物学技术，将编码香紫苏醇合成途径的外源基因引入酿酒酵母，通过系统的代谢工程改造，实现植物源天然产物香紫苏醇的可持续生产，降低对传统植物提取的依赖，具有不依赖栽培环境、不受气候场地限制、节约土地资源、环境友好等众多优点。一旦确定宿主细胞成功表达外源基因，后续进行优化发酵条件探索，包括培养基成分和pH，以提高香紫苏醇的产量。

香紫苏醇(C20H36O2)是一种半日花烷型二萜二叔醇，常用于化妆品和香水的香料成分及食品调味材料。它是唯一实用的天然龙涎香代用品降龙涎醚化学合成的原料。因此，香紫苏醇具有较高经济价值。此外，香紫苏醇还是潜在抗肿瘤药物，对人类多种癌细胞如白血病细胞[1]、肿瘤细胞和结肠癌细胞[2]均有细胞毒性。目前香紫苏醇主要从植物中提取，但植物生长周期长，生长易受土地、环境及气候等因素影响。而且植物中香紫苏醇含量较低，从 1 000 kg 干草中仅可获得 15 kg 香紫苏醇，难以满足工业化需求[3]。

进入新世纪以来，在合成生物学思想的驱动下，通过生物合成途径解析，在微生物中重构中药活性成分的生物合成途径，结合代谢流调控和发酵条件优化，通过异源表达相关基因或构建人工合成途径，已成功实现萜类化合物如紫杉醇前体[4]、番茄红素[5]、次丹参酮二烯[6]等的微生物生产。Schalk 等[7]以大肠杆菌为宿主，过表达真核生物的甲羟戊酸途径及香紫苏醇生物合成关键酶，结合高密度发酵技术，香紫苏醇产量达到 1.5 g/L。相对于大肠杆菌，酿酒酵母生物安全性好，异戊二烯代谢途径活跃，可有效供给萜类化合物生物合成前体，并且酿酒酵母可更好地兼容其他植物源基因以及细胞色素 P450 氧化酶，有利于复杂萜类化合物的人工合成途径构建。杨薇等[8]构建了表达焦磷酸赖百当烯二醇酯合酶和香紫苏醇合酶的酿酒酵母工程菌株，摇瓶培养条件下，香紫苏醇产量达到 8.9 mg/L。

[1] Dimas K, Kokkinopoulos D, Demetzos C, et al. The effect ofsclareol on growth and cell cycle progression of humanleukemic cell lines. Leuk Res, 1999, 23(3): 217–234.
[2] Mahaira LG, Tsimplouli C, Sakellaridis N, et al. The labdanediterpene sclareol (labd-14-ene-8, 13-diol) induces apoptosisin human tumor cell lines and suppression of tumor growthin vivo 8, 13-diol) induces apoptosisin human tumor cell lines and suppression of tumor growthin vivovia a p53-independent mechanism of action. Eur JPharmacol, 2011, 666(1/3): 173–182.

[3] Caissard JC, Olivier T, Delbecque C, et al. Extracellularlocalization of the diterpene sclareol in clary Sage (Salviasclarea L., Lamiaceae). PLoS ONE, 2012, 7(10): e48253.
[4] Ajikumar PK, Xiao WH, Tyo KE, et al. Isoprenoid pathwayoptimization for taxol precursor overproduction inEscherichia coli. Science, 2010, 330(6000): 70–74.
[5] Yoon SH, Kim JE, Lee SH, et al. Engineering the lycopenesynthetic pathway in E. coli by comparison of the carotenoidgenes of Pantoea agglomerans and Pantoea ananatis. Appl
Microbiol Biotechnol, 2007, 74(1): 131–139.
[6] Zhou YJ, Gao W, Rong Q, et al. Modular pathwayengineering of diterpenoid synthases and the mevalonic acidpathway for miltiradiene production. J Am Chem Soc, 2012,134(6): 3234–3241.
[7] Schalk M, Pastore L, Mirata MA, et al. Towards abiosynthetic route to sclareol and amber odorants. J AmChem Soc, 2012, 134(46): 18900–18903.
[8] Yang W, Zhou YJ, Liu WJ, et al. Engineering Saccharomycescerevisiae for sclareol production. Chin J Biotech, 2013,29(8): 1185–1192 (in Chinese).
杨薇, 周雍进, 刘武军, 等. 构建酿酒酵母工程菌合成香紫苏醇. 生物工程学报, 2013, 29(8): 1185–1192. 

1.新构思：对香紫苏醇产业链来说，还没有出现全生物生产工艺，其下游产物还需要靠化学合成来生产，这会造成过多的污染。本项目旨在通过构建工程菌完成香紫苏醇的全生物合成生产工艺。这是一个全新的尝试。

2.预期的新成果：通过本项目的努力，将构建出一条完整的香紫苏醇全生物合成路线，极大提高香紫苏醇生产的规模及经济效益，同时可以减少原生产工艺中下游产物的化学合成途径产生的污染，兼具经济效益与环境效益。

（1）构建质粒：采用GGGS为linker，融合香紫苏醇合成的两个基因LPPS和TPS，并在融合基因的N末端用GGGGS为linker链接麦芽糖结合蛋白（MBP）以提高融合蛋白稳定性

（2）构建工程菌株：设计相关引物，PCR扩增后得到目标DNA片段，转化到原始酵母菌株内，得到正确工程菌株。

（3）产物检测：将成功导入质粒的工程菌进行发酵培养24h后，在培养基上覆盖有机溶剂，使香紫苏醇被萃取到有机相中。七天后下发酵，检测香紫苏醇含量

（4）评估最适pH：在成功得到较大量产物后，设计pH梯度培养基测定最适发酵pH

2024年9月——2024年10月：查阅并整理往年国内外相关资料；

2024年10月——2024年11月初：组内开始分工并自主设计、撰写项目研究方案与项目计划书并于11月 日完成。

2024年10月：加入课题组进行相关实验研究。

2024年11月——2025年3月：进行数据统计、处理与分析

2025年3月——2025年6月：完成中期检查

2025年7月——2025年10月：结题表填写、撰写研究论文和总结报告、参加结题答辩和成果推广等等

香紫苏醇作为龙涎香替代物质———降龙涎醚的前体物质， 其合成研究一直受到研究人员的重视，前期人们的注意力主要集中于天然植物提取。获取香紫苏植物的茎叶及花器官，运用蒸馏法及固/液相提法从植物的组织中提取得到香紫苏醇。进 入 21 世纪以来，随着生物技术的发展，人们可以通过基因工程的方法构建目的产物的生物合成途经，进而选择宿主构建工程菌株来生产目标产物。

在香紫苏醇的研究方面，国内外学者做了大量的工作，在基因工程菌构建，代谢调控，发酵过程优化等各方面做出了突出的贡献。杨薇等综合运用基因工程及代谢工程方法，通过高密度培养，所构建的酿酒酵母工程菌在分别以葡萄糖、乙醇、葡萄糖/乙醇为碳源的情况下，产 量 分 别 达 到 253 mg /L， 386 mg /L，408 mg /L 。香紫苏的香紫苏合成由半日花烷型二醇二磷酸合酶及二萜合酶催化完成，构建包含编码这两个酶基因的代谢途径，将其导入酿酒酵母中构建工程菌，运用代谢工程方法，构建融合蛋白并去除上述催化酶的信号肽，过表达关键酶的方法，可以提高终产物的产量。国际著名日用化公司，如芬美意也在大肠杆菌中构建香紫苏醇的生物合成途经，终产物产量可以达到 1.5 g /L 。甲羟戊酸途径( MVA) 和甲基磷酸赤藓糖途径( MEP) 是合成香紫苏醇前体物质———IPP ( 异戊二烯焦磷酸) 的 主 要 途 经，甲 羟 戊 酸 途 径( MVA）主要存在于原核生物中，如大肠杆菌。甲基磷酸赤藓糖途径( MEP) 主要存在于真核生物中，如酿酒酵母，相比甲羟戊酸途径途径，甲基磷酸赤藓糖途径更有利于碳代谢流流向合成香紫苏醇的前体物——IPP ( 异戊二烯焦磷酸) ，从而更有利于提高终产物的产量。根据这一原理，利用 MEP 途径高产 IPP( 异戊二烯焦磷酸) 的特性，利用酿酒酵母来生产香紫苏醇更具有优势。

在调控香紫苏醇上游合成代谢途经的研究上，学者们也做出了大量的工作。法尼基焦磷酸( FPP) 是所有二萜类物质的前体物质，提高法尼焦磷酸的产量也有助于提高终产物——香紫苏醇的产量，Moran Farhi 等研究发现控制酵母菌细胞内分区可以提高 FPP 产量，FPP 产量提高有助于香紫苏醇的合成。由于 3 － 羟基 － 3 － 甲基戊二酸单酰还原酶( HMG－Ｒ) 是香紫苏醇的前体物 GGPP合成途经中重要等，Oht 等过表达重定向代谢流的酶类以及改变 HMG － Ｒ 催化结构域可以提高 GGPP 的产量，可以用于提高香紫苏醇产量的生产，同时过表达 3 － 羟基－ 3 － 甲基戊二酸单酰辅酶 A ( HGM － CoA) 还原酶同样能够提高前体物质，学者对其它二萜类物质的研究同样可以给香紫苏醇的研究提供一些思路。另外，Fotini 等也通过基因工程方法，将 FPP 合酶的基因导入到酿酒酵母中可以提高 GGPP 的产量，而共表达特定的 FPP 合酶和香紫苏醇合成途经的关键酶——二萜合酶，也可以提高香紫苏醇的最终产量。鉴于在工程菌中，香紫苏醇合成是一个比较长的途经，涉及到比较多的酶类，对关键酶类的调控可以增加流向终产物的代谢流，这应该是今后的一个较为重要的研究方向。

除了构建香紫苏醇生物合成途经，研究人员也在无细胞催化方面做出了研究，郭振华等通过粘毛烟草的毛状体提取物无细胞催化，可以得到由 GGPP 转化而来的终产物香紫苏醇，这其中涉及的酶和其它的植物萜类环化酶具有结构上的相似性。综上所述，前人的研究主要是运用基因工程方法构建异源表达途经，寻找合适的宿主进行表达，再综合运用代谢工程的方法对发酵培养条件进行优化，以提高终产物的产量。同时，也有更多的人在上游的代谢途径做出了一些比较重要的贡献，这也同时给后面的学者提供了更多的研究方向，有助于香紫苏醇研究的发展及工业上的应用。

 

华东理工大学徐汇校区鲁华生物技术研究所4楼

无菌超净工作台，HS-800D恒温水浴锅，恒温培养箱，立式高压蒸汽灭菌锅，电子天平，MQL-61R型立式振荡培养箱，HE-120型中号水平核酸电泳仪，DW-84L486型超低温保存箱，STARTER 2C基础型pH计，Gene-Pulse Xcell电穿孔仪，NanoDrop核酸检测，MiniProGel?蛋白制胶与电泳系统，Cytation 3 多功能酶标仪，Mastercycler Pro型梯度PCR仪，5424R型台式离心机，5415D型台式离心机，移液枪ES-VM25涡旋混匀仪，WFH-204B手提式紫外分析仪，LGJ-12真空冷冻干燥机，BLBIO-1GC4型发酵罐，薄层色谱铝箔板，高效液相色谱仪 Agilent 1100，气相色谱仪Agilent 7820 A液-质联用仪Agilent 1100 LC/MSD，Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18 柱，Agilent ZORBAX 5 HC-C18 柱，Agilent DB-5气相色谱柱，FastPrep-24型MP均质破碎仪JY92-2D细胞超声破碎仪

生物反应器工程国家重点实验室仪器平台：

质谱联用仪、二维液相色谱仪、超高压液相色谱仪、超速离心机、全自动四维细胞生物学显微镜，激光扫描共聚焦显微镜、各种荧光成像系统以及蛋白质工程计算模拟工作站等，为本项目工作的开展提供了重要保障。

华东理工大学分析测试中心：

核磁共振波谱仪、高分辨质谱仪，红外光谱仪、元素分析仪，飞行质谱仪、电子扫描显微镜、激光透射显微镜、激光扫描仪、X-射线扫描光谱仪、原子应力测定仪、热重分析仪等仪器设备和服务平台，为该研究提供完备的分析测定条件。

此外，申请者课题组拥有常规多功能酶标仪、高通量分样仪、PCR 仪、荧光定量 PCR仪、电转仪、杂交仪、核酸分析仪、气相和液相色谱仪以及半制备液相色谱仪等基本生物学仪器，可以满足本项目对常规生化分析和遗传操作等的基本需求。

经费预算

开支科目 预算经费（元） 主要用途 阶段下达经费计划（元）
前半阶段 后半阶段
预算经费总额 15000.00 实验耗材及测试用费 5500.00 9500.00
1. 业务费 6000.00 无 2000.00 4000.00
（1）计算、分析、测试费 6000.00 菌株测序，质谱分析 2000.00 4000.00
（2）能源动力费 0.00 无 0.00 0.00
（3）会议、差旅费 0.00 无 0.00 0.00
（4）文献检索费 0.00 无 0.00 0.00
（5）论文出版费 0.00 无 0.00 0.00
2. 仪器设备购置费 0.00 无 0.00 0.00
3. 实验装置试制费 0.00 无 0.00 0.00
4. 材料费 9000.00 实验材料消耗 3500.00 5500.00

项目附件

  • 大学生创新创业训练计划项目申报书-创新训练类.docx
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结束

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