1.研究方法

1.1            1.1生物信息学分析

（1）序列比对与系统发育分析：对 PLP 酶 CsmE 及相关同源蛋白进行序列比对，构建系统发育树，分析其在 PLP 依赖酶家族中的进化关系，预测其可能的功能和催化特性。

（2）基因簇分析：研究 PLP 酶 CsmE 所在基因簇的结构和组成，分析基因簇中其他基因与 CsmE 的协同作用关系，推测其在生物合成途径中的角色。

1.2蛋白质表达与纯化

（1）克隆与表达：将编码 PLP 酶 CsmE 的基因克隆到合适的表达载体中，转化至宿主细胞（如大肠杆菌、酵母等），通过诱导表达获得重组蛋白。

（2）蛋白纯化：采用亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等方法对表达的重组蛋白进行纯化，获得高纯度的 PLP 酶 CsmE 用于后续实验。

1.3新颖后修饰基因的功能鉴定

（1）功能解析：根据推测的生物合成途径，设计串联表达，底物饲喂，敲除，体外酶反应等实验对新颖生物合成基因的功能进行解析。

（2）定点突变：对 PLP 酶 CsmE 的关键氨基酸残基进行定点突变，研究突变对酶活性的影响，确定参与催化反应的关键残基。

1.4酶活性测定与动力学分析

（1）建立酶活性测定方法：根据 PLP 酶 CsmE 可能的催化反应，设计合适的酶活性测定体系，通过检测底物的消耗或产物的生成来确定酶活性。

（2）动力学参数测定：测定不同底物浓度下的酶反应初速度，采用米氏方程拟合数据，计算酶的米氏常数（Km）、最大反应速率（Vmax）等动力学参数，分析酶对底物的亲和力和催化效率。

1.5结构生物学研究

（1）晶体结构解析：尝试结晶 PLP 酶 CsmE，利用 X 射线晶体衍射技术收集衍射数据，解析其三维结构，确定活性中心的结构特征、PLP 辅因子的结合模式以及与底物的相互作用位点。

（2）冷冻电镜技术（如有需要）：若晶体结构解析困难，可考虑采用冷冻电镜技术研究 PLP 酶 CsmE 在溶液中的结构状态，获取其结构信息。

1.6量子化学计算与模拟

（1）反应机理模拟：运用量子化学计算方法，对 PLP 酶 CsmE 催化反应的过渡态、中间体进行计算模拟，分析反应过程中的电子转移、化学键变化等微观过程，揭示催化反应的机理。

（2）结合模式分析：计算 PLP 酶 CsmE 与底物、产物的结合能，分析它们之间的相互作用模式，探讨影响酶催化活性的关键因素。

2.研究难点与重点

1.结构解析困难：CsmE 蛋白的表达量可能较低，难以获得足够量的蛋白用于结构解析；其结构可能不稳定，容易发生构象变化，影响晶体生长和结构测定的准确性；此外，CsmE 可能存在翻译后修饰等复杂情况，增加了结构解析的难度。

2.催化机理研究复杂：CsmE 的催化反应可能涉及多个步骤和复杂的中间体，准确捕捉和鉴定这些中间体具有挑战性；由于 PLP 在催化过程中的作用机制复杂，且 CsmE 可能与其他蛋白质或分子存在相互作用，从而影响其催化机理，区分这些因素的具体贡献较为困难。

3.实验数据与计算模型的整合：实验方法和计算方法得到的数据在类型、精度和可靠性等方面存在差异，如何将二者有机结合，相互验证和补充，以构建准确的催化机理模型是一个难点。例如，实验测定的活性数据可能受到多种因素干扰，而计算模型的假设和参数设置可能影响其对实际催化过程的模拟准确性。

4.量子化学计算的复杂性：PLP 酶 CsmE 与底物的相互作用涉及多个原子和化学键，量子化学计算的难度较大，需要选择合适的计算方法和参数，以确保计算结果的可靠性。

5.酶活性测定的干扰因素：PLP 酶 CsmE 的催化反应可能受到多种因素的影响，如温度、pH 值、离子强度等，需要严格控制实验条件，排除干扰因素，以准确测定酶活性。

6.定点突变的不确定性：定点突变可能会导致酶的结构和功能发生不可预测的变化，需要进行大量的实验验证，以确定突变对酶活性的影响。

3.项目研究的主要内容及目标

3.1主要内容

1.CsmE 的结构解析

表达和纯化 CsmE 蛋白，优化表达和纯化条件，提高蛋白的产量和纯度。

运用 X - 射线晶体学或冷冻电镜技术获取 CsmE 的三维结构，分析其二级结构、三级结构特征，确定活性中心和辅因子结合位点等关键结构域。

研究 CsmE 与其他相关蛋白质或分子的相互作用，探讨其在生物体内的作用模式和功能调节机制。

2.CsmE 的催化机理研究

测定 CsmE 的酶活性，分析其对不同底物的催化活性和动力学参数，确定最适反应条件和底物特异性。

运用量子化学计算和分子动力学模拟方法，研究 CsmE 催化反应的过渡态、中间体和反应路径，揭示其催化反应的分子机制。

探讨辅因子 PLP 在 CsmE 催化过程中的作用机制，包括其与酶蛋白的结合方式、电子转移过程以及对催化活性的影响。

3.结构与功能关系研究

通过定点突变等技术改变 CsmE 的关键氨基酸残基，研究突变体的结构变化和酶活性变化，确定对催化功能至关重要的氨基酸残基。

分析 CsmE 的结构动态变化与其催化功能之间的关系，揭示结构柔性在催化过程中的作用。

研究环境因素（如温度、pH 值、离子强度等）对 CsmE 结构和功能的影响，建立结构 - 功能关系模型。

国内外同类研究工作的现状

1 PLP 依赖酶的结构与功能研究

国内外众多研究对 PLP 依赖酶的结构和功能进行了广泛探索。已解析出多种 PLP 依赖酶的晶体结构，如酵母 4 - 氨基 - 4 - 脱氧分支酸裂解酶（yeast Abz2）、赖氨酸脱羧酶等，这些研究揭示了 PLP 依赖酶的活性中心结构、底物结合模式等重要信息，为理解其催化机制奠定了基础。同时，对 PLP 依赖酶催化的反应类型也有深入研究，包括转胺、克莱森缩合、β 消除、β 取代、γ 消除、γ 取代、异构化及脱羧等反应，并且明确了这些反应在天然产物生物合成中的重要作用。

2 酶催化机理的研究方法

常用的研究方法包括蛋白质结构解析方法（如 X 射线晶体衍射、核磁共振等）、单分子分析检测技术及计算机模拟技术（如量子化学计算、分子动力学模拟等）。这些方法相互结合，从不同层面深入剖析酶的催化机理。例如，通过蛋白质结构解析确定酶的三维结构，再利用量子化学计算方法研究酶与底物的相互作用、反应中间体和过渡态结构等，从而全面理解酶的催化过程。

3 杂萜生物合成途径

在本课题中，我们开发了基于蛋白家族出现频率的生物信息学算法用来锁定倍半萜生物合成中不寻常的后修饰酶。通过这个算法，我们成功定位到了PLP依赖酶。

在本工作前，所有已报道的杂萜生物合成途径可以分为两类，一类需要异戊二烯转移酶将萜类部分加载到非萜类部分上，在生物合成基因簇上会有一个特征性的异戊二烯转移酶，比如杂萜 pyripyropene A， yaminterritrem B 及 mycophenolic acid 等的生物合成。另一类首先由萜类合酶环化生成萜类骨架，然后由PKS或NRPS合成非萜类部分，最终由一个连接酶将两者连接在一起，在生物合成基因簇上会同时存在萜类合酶及PKS或NRPS，比如fumagillin，flavunoidine 及aculane A等的生物合成。

而在本课题中的杂萜的生物合成方式不同于前两种，是由PLP依赖酶将氨基酸基团连接到萜类骨架上，这也是一条全新的杂萜生物合成途径。

通过对含PLP依赖酶的基因簇进行异源表达，我们分离鉴定了两个新颖杂萜，并通过串联表达初步解析了其生物合成途径，根据其结构，我们推测PLP依赖酶可以催化氨基酸和萜类之间形成醚键从而生成杂萜分子。

4 酶工程策略推动酶的开发和优化

自然界中存在的酶拥有多种多样的功能，它们已经被应用在工业生产和学术研究中，但其中许多酶的性质和功能还不能完全满足应用需要，通过改造来提升这类酶的某些特性是酶工程的重要任务。酶工程主要包括理性设计、定向进化、半理性设计和人工智能辅助设计等策略。理性设计方法根据酶的催化机理、结构等先验知识进行改造。定向进化技术通过构建随机突变文库和高通量筛选提升目标酶的稳定性和活性等性质。半理性设计方法借助一系列计算方法构建相比于定向进化更小也更合理的突变文库以降低筛选工作量。人工智能技术在大量数据驱动下可以学习有关蛋白质构成和进化的特征信息。

酶分子的理性设计是利用各种生物化学、生物物理、结构生物学方法获得有关酶分子的结构、性质和功能的信息，并基于已知结构和功能之间的关系，改变酶分子中个别氨基酸残基和结构域改造酶分子，甚至设计并预测酶的空间结构并从头开始设计酶的一级结构，以期获得具有新性状的突变酶。

整合生物化学、结构生物学和计算化学的方法可以为解析 PLP 酶 CsmE 的催化机理提供更全面、深入的理解。通过生物化学方法可以测定酶的活性、底物特异性和抑制剂等信息；通过结构生物学方法可以提供酶的三维结构信息；通过计算化学方法可以提供酶催化反应的理论模型。将这些方法相结合，可以更好地理解 PLP 酶 CsmE 的催化机理，为开发新型药物和生物技术提供理论基础。

而在本课题中的杂萜的生物合成方式不同于先前任何一种，是由PLP依赖酶将氨基酸基团连接到萜类骨架上，这也是一条全新的杂萜生物合成途径。使用全新技术方法定位到此类酶，是首例PLP酶催化萜类中间体和高丝氨酸的藕联。

后续我们计划尝试酵母底盘和利用本源激活或敲除的方法对其进行研究，并挑选更多的含PLP依赖酶的倍半菇生物合成基因簇进行异源表达。

同源蛋白序列比对、调取所有同源蛋白、SSN分析确定该酶所处的分区、分区是否和催化功能及反应类型关联。阐明 CsmE 的三维结构特征，明确其活性中心和辅因子结合位点的结构特点。解析 CsmE 的催化机理，包括底物识别、结合、催化反应的具体步骤以及产物释放过程。揭示 CsmE 结构与功能之间的关系，确定影响其催化活性和特异性的关键结构因素。基于研究成果，为开发基于 CsmE 的新型生物催化剂或生物合成途径提供理论依据，推动生物化学领域相关技术的发展。

预期成果：

1.申请专利1项；

2.发表高水平SCI论文1篇；

3.参加中国国际“互联网+”大学生创新创业大赛和“挑战杯”全国大学生课外学术科技作品竞赛。

1.     总体进程

查阅有关PLP依赖酶的相关资料，学习相关有机化学、生物信息学、生物化学、分子生物学的相关知识和实验操作，了解实验室在PLP依赖酶的相关知识与进展，设计实验并准备好实验相关材料，对接好实验室的相关实验工作。实验正式开展之后，利用好专业知识，向指导教师与师兄师姐学习相关研究方法和基本实验操作，最终对PLP依赖酶的CsmE的催化机理进行解析。

2.     工作安排

2025年1月～2025年3月，查阅文献资料、学习基本实验技术方法、设计实验流程

2025年4月～2025年12月，按照相应流程进行实验，进行中期检查，与指导教师讨论并完善实验方案

2026年 1月～2026年5月，检验实验结果、撰写研究论文