聚乙二醇化益生菌的免疫反应研究

申报人：张慧晶申报日期：2024-11-07

基本情况

所属批次:

2025年度大学生创新创业训练计划

项目名称:

聚乙二醇化益生菌的免疫反应研究学生选题

项目类型:

创新训练项目

所属一级学科:

工学

所属二级学科:

生物工程类

项目来源名称:

学生自主选题

项目归属学院:

项目期限:

一年半期

项目简介:

聚乙二醇化益生菌可以更稳定地存在于体内，延长作用时间，调节肠道免疫细胞的活性，增强肠道黏膜屏障功能。然而，其引起的免疫学效应还不清楚。本项目将设计制备聚乙二醇化的益生菌，并对其引起的宿主免疫反应进行研究。

负责人曾经参与科研的情况:

1.在贯通式实践课题中报名了赵梦瑶老师的食源性天然产物对神经退行性疾病的干预效果及作用机制课题，取得“优秀”评价。

指导教师承担科研课题情况:

1. 国家自然科学基金青年项目，2023.01~2025.12，30万元，在研，主持.

2. 上海市科学技术委员会启明星培育(扬帆专项)，2022.04~2025.03，20万元，在研，主持

指导教师对本项目的支持情况:

1. 指导教师教给学生相关基础知识，培养学生对于生物医药研究的兴趣。

2. 指导教师具备项目所需的研究平台，指导学生具体实验操作和数据分析，培养学生的科研思维和研究能力。

项目级别:

市级

项目成员

序号	学生	所属学院	专业	年级	项目中的分工	成员类型
1	张慧晶	生物工程学院	生物工程	2023	团队主心骨，负责项目进程安排，制定各阶段任务，联系导师，汇报进度。	第一主持人
2	诸思怡	生物工程学院	生物技术	2023	负责项目预算及预算执行情况监控，财务、经费的管理与审批；处理与审核经费使用票据及报销单据	第二主持人
3	李世凡	生物工程学院	生物技术	2023	负责撰写相关材料，如立项申请书、结题报告。	成员
4	林于博	药学院	制药工程	2023	负责制作汇报ppt、答辩、实验数据的统计与处理、图表制作。	成员

指导教师

序号	教师姓名	教师账号	所属学院	是否企业导师	教师类型
1	张东辉	09247	生物工程学院	否	第一指导教师

立项依据

研究目的:

本研究旨在探讨聚乙二醇（PEG）化益生菌在肠道免疫治疗中的应用潜力。近年来，利用工程菌进行治疗已成为一个备受关注的研究领域，研究者们通过多种方法改善细菌功能，以实现肿瘤特异性递送和免疫调节。具体而言，本研究将聚焦于PEG化修饰的益生菌，评估其在肠道中的定植能力及其对免疫反应的影响。聚乙二醇作为一种惰性且生物相容性的合成聚合物，能够提高药物的水溶性和稳定性，降低酶降解和免疫原性。然而，近年来的研究表明，健康人群中存在抗PEG抗体，并且PEG与大分子结合时可能表现出免疫原性。因此，本研究将系统评估PEG化益生菌的免疫效应及其潜在副作用，以为其在临床应用中的安全性和有效性提供科学依据。

研究内容:

国、内外研究现状和发展动态:

2024年5月，Yanmei Chen等发现通过对多种益生菌进行聚乙二醇修饰可以促进它们在肠粘液层中的渗透并延长滞留时间，可以加强肠粘膜屏障，调节肠道免疫细胞的活性，抑制病原菌入侵，维持肠道稳态，提供了有助于预防和治疗胃肠道疾病乃至防止糖尿病的可能解决方案。尽管在一些案例中，当PEG在特定分子量下或与某些纳米颗粒或蛋白质结合时有产生毒性的案例，毒性证据包括泡沫细胞数量增加，阳性巨噬细胞显著增加，细胞空泡化等，实验证明该研究中涉及的聚乙二醇修饰的益生菌并不具有显著的细胞毒性。该团队先将聚多巴胺(PDA)修饰在益生菌表面，再将m-PEG-NH2锚定在PDA纳米颗粒上，并通过在溶原肉汤琼脂平板上进行细菌平板计数来评估聚乙二醇化的细胞毒性，初步证明了聚乙二醇化益生菌的口服安全性。但聚乙二醇作为一种半抗原，在与益生菌结合后是否会因为免疫而产生副作用或影响治疗效果，仍有待进一步的研究。另一方面：尽管实验证明益生菌引起了对肠道免疫细胞活性的调节，其免疫学效应还不清楚。

除了对PEG化细菌细胞毒性的检验，Chen团队还通过使用异硫氰酸荧光素短暂孵育标记沉积的PDA，使用RhB标记的PEG共沉积，用LSCM图像检测PEG修饰成功，以及细菌的生长和活力不受影响。接着，通过对照实验发现较之未被包被的细菌(EcN)和仅修饰PDA的细菌(EP)，完成PEG修饰的细菌(EPP)在更深的位置呈现出高度的荧光强度，即PEG强化了细菌的渗透性。然后将PEG化细菌在小鼠体内进行实验，通过体内成像系统(IVIS)证明了EPP在肠粘液中的有效定位，以及在离体猪模型中通过IVIS进一步证明了其滞留时间长，保留有效；最后建立健康小鼠-PBS处理感染小鼠和以EcN、EP、EPP处理小鼠的对照组，通过 16S 核糖体 RNA 基因测序分析微生物组成，表明聚乙二醇化细菌具有阻止病原菌入侵的治疗效果。

虽然将聚乙二醇修饰在整个益生菌上具有新颖性，但这种修饰通过PDA纳米颗粒在中间连接，可以参照这方面的现有研究方法。PDA是一种非蛋白质的纳米颗粒，因此更多的应该参照聚乙二醇修饰在一些纳米颗粒上产生免疫反应的相关研究。例如，封装寡核苷酸或质粒 DNA 的 PEG 修饰脂质体在小鼠体内会产生抗 PEG 抗体，这导致了在第二次注射脂质体后出现严重的超敏反应，包括面部肿胀、血管扩张和过敏性休克。使用 Onpattro?(一种封装在 PEG 修饰的 LNP 中的 siRNA 药物)治疗后也报道了输液相关反应。

此外，现有研究会使用到下列对PEG抗体的检测技术：最早的研究使用被动凝血法，几年来因为缺乏准确性、灵敏度和定量而使用较少。酶联免疫吸附试验(ELISA)随着技术发展具有很高的敏感性，可以明确抗PEG抗体与不同PEG结合物的交叉反应性，但尚且无法对现有抗体定量，只能估算相对含量，给不同研究带来比较困难。此外还有流式细胞术，MSD技术和表面等离子共振技术。

研究的难点在于，通过PEG化修饰工程菌作为一种较新颖的技术设想，与传统药物递送中的PEG修饰不同，其修饰对象不再是离散、小体积的药物单体，并且没有针对细胞整体修饰PEG具体的既有研究。同时，由于人体可能因为提前在消费品和药物中接触PEG，而与动物实验的初次给药有所区别；这可以通过提前建立含PEG抗体的模型或多次给药解决。除了PEG对细菌定位和运动的影响，细菌是否因为PEG修饰产生其它生理改变，也有待研究。

创新点与项目特色:

1.思维创新性

本项目将主要问题聚焦于聚乙二醇化益生菌的免疫反应这一尚未被学界广泛了解的领域，具有创新性思维。

2.技术创新性

本项目采用酶联免疫吸附实验（ELISA实验）间接法进行抗-PEG抗体的定量检测，运用创新技术展开研究。

3.组织结构创新性

本项目联合生物工程学院与药学院专业的同学进行研究，实现多领域、多专业的合作交流。

技术路线、拟解决的问题及预期成果:

项目将通过研究聚乙二醇（PEG）化益生菌的免疫反应，探讨其在体内的安全性和有效性。具体而言，项目将评估PEG化益生菌在接种后引发的免疫反应水平及其可能的副作用。预计结果将揭示PEG化益生菌对宿主免疫系统的影响，包括对特定免疫细胞的激活和抗体产生的变化。

该项目成功后，预期将发表一篇核心期刊论文，重点分析PEG化益生菌引起的免疫反应。论文将详细介绍本项目的创新点，包括PEG化益生菌的制备方法、免疫反应的评估技术、相关的基础理论知识以及实验过程中收集的数据及对其的分析。通过对PEG化益生菌的免疫特性进行深入研究，旨在解决其在临床应用中可能面临的免疫问题，为开发新型益生菌制剂奠定基础。希望本项目能够为益生菌研究领域提供新的见解和贡献。

项目研究进度安排:

本项目的研究期限：2024年11月-2026年6月

1、第一阶段（准备工作）：

（1）大量查阅有关专业文献并总结当前国内外研究成果，分析现有文献的欠缺之处，在本次研究中逐一完善：2024.11月~ 2024.12月

（2）研讨和设计项目研究方案，开始进行前期的实验准备工作：2025.1月~2月

（3）学习实验所需技术，围绕聚乙二醇化益生菌的免疫反应展开研究实验：2025.3月～9月

（4）对多次实验得到的结果进行数据统计比较和论文撰写： 2025.10月~12月

2、第二阶段（进行阶段）：

（1）中期答辩：根据前期的试验结果数据分析和比较准备中期检查

（2）数据计算2026.1月~2026.2月

3、第三阶段（汇总报告）：

撰写研究论文和总结报告、填写结题表和参加结题答辩和成果推广 2026.3月~ 2026.6月

已有基础:

与本项目有关的研究积累和已取得的成绩:

1.PEG修饰益生菌的渗透性和滞留时间：

研究表明，通过对多种益生菌进行聚乙二醇（PEG）修饰，可以促进其在肠粘液层中的渗透并延长滞留时间，从而增强肠粘膜屏障，调节肠道免疫细胞的活性，抑制病原菌入侵，维持肠道稳态。

2.免疫调节和疾病预防：

PEG化益生菌提供了预防和治疗胃肠道疾病及防止糖尿病的潜在解决方案。

3.细胞毒性评估：

实验证明，聚乙二醇修饰的益生菌并不具有显著的细胞毒性，尽管在某些情况下PEG可能表现出毒性。

4.安全性验证：

通过将聚多巴胺（PDA）修饰在益生菌表面，并锚定m-PEG-NH2，研究团队初步证明了PEG化益生菌的口服安全性。

5.荧光标记和成像：

使用异硫氰酸荧光素和RhB标记的PEG进行沉积标记，成功检测到PEG修饰的细菌在肠粘液中的有效定位，并证明其滞留时间长。

6.微生物组成分析：

通过16S核糖体RNA基因测序分析微生物组成，表明聚乙二醇化细菌具有阻止病原菌入侵的治疗效果。

7.对比实验：

通过对照实验，发现PEG修饰的细菌在更深的位置呈现出更高的荧光强度，表明PEG增强了细菌的渗透性。

8.技术方法的创新：

采用PDA纳米颗粒作为PEG修饰的中间连接，展示了聚乙二醇修饰在益生菌上的新颖性。

9.对PEG抗体的检测技术：

研究中提到的抗PEG抗体检测技术，包括酶联免疫吸附试验（ELISA）、流式细胞术等，为后续研究提供了方法基础。

10.研究挑战：

识别了通过PEG化修饰工程菌的研究难点，强调了与传统药物递送中PEG修饰的不同之处，并提出了未来研究的方向。

已具备的条件，尚缺少的条件及解决方法:

1.PEG修饰的免疫原性研究：

目前尚缺乏对PEG修饰益生菌可能引发的免疫反应及其副作用的深入研究。

2.长期安全性和有效性数据：

需要更多的长期研究数据来确认PEG化益生菌在临床应用中的安全性和有效性。

3.对PEG抗体的定量检测：

现有的抗PEG抗体检测方法尚无法对抗体进行定量，限制了对免疫反应的全面评估。

4.对PEG修饰对细菌生理影响的研究：

需要进一步研究PEG修饰对细菌生理特性的影响，以了解其在体内的行为。

经费预算

开支科目	预算经费（元）	主要用途	阶段下达经费计划（元）
开支科目	预算经费（元）	主要用途	前半阶段	后半阶段
预算经费总额	15000.00	无	6500.00	8500.00
1. 业务费	7000.00	测试阶段实验结果、交通费、资料费	2500.00	4500.00
（1）计算、分析、测试费	3000.00	阶段性成果的检验与测试	1500.00	1500.00
（2）能源动力费	0.00	无	0.00	0.00
（3）会议、差旅费	2000.00	主要用于资料打印，组织会议，小组成员于奉献和徐汇校区往返交通	1000.00	1000.00
（4）文献检索费	0.00	无	0.00	0.00
（5）论文出版费	2000.00	用于论文出版	0.00	2000.00
2. 仪器设备购置费	2000.00	实验场地的租借及维护	1000.00	1000.00
3. 实验装置试制费	0.00	无	0.00	0.00
4. 材料费	6000.00	购买实验试剂，器材及维护所需	3000.00	3000.00

项目附件

大学生创新创业训练计划项目申报书-创新训练类3.0(1).doc

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结束

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