灰霉病（Gray mold disease）是由灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）感染所致的一种常见真菌病害，被称为世界第二严重植物病原体。灰霉病能够危害茄科、葫芦科、蔷薇科等470多种植物，引起植株叶片大量脱落，果蔬腐烂，产品质量下降。该病害每年在全球造成的经济损失超过100亿美元。在中国，草莓种植因灰霉病一般会造成减产20%～30%，严重时高达50%以上。番茄减产可达20%～30%，甚至高达50%。

而由于单作用位点杀菌剂的频繁使用，在我国山西、天津、辽宁、河南、上海等番茄种植地区均已发现灰霉病菌对多菌灵、腐霉利、嘧霉胺、氟吡菌酰胺、嘧菌酯、啶酰菌胺等多种杀菌剂产生了不同程度抗性。

灰霉病具有传播速度快、寄主范围广以及严重的抗药性问题，灰霉病的病原菌对多种常用的单靶标化学杀菌剂极易产生高程度的抗性，导致这些药剂的防效明显下降。抗药性的快速增长使得灰霉病的防控难度逐年加大。如何长期有效和稳定地控制番茄灰霉病，最经济有效的方法就是开发新的替代杀菌剂，这是目前生产上的迫切需求。

本研究目基于以真菌细胞膜表面上的两种功能蛋白（谷氨酰胺转酶（TGase）和14α-甾醇脱甲基酶（CYP51））为靶点研究新型双靶点抗真菌药物，从而克服单靶标抗菌剂抗菌谱窄、抗药性易增长等问题。

众多的田间研究数据表明，由于作用靶标位点单一，灰葡萄孢菌（B. cinerea）极易对这些杀菌剂产生抗药性，具有极高的抗性频率，甚至已经出现了适应于多种杀菌剂的高抗或多抗菌株。尤其是，抗性和敏感性灰葡萄孢菌在生长、毒力和分生孢子方面没有显著差异，且在田间都具有较高的适应性。生产上亟需通过降低药剂选择压力，来延缓抗药性的产生和提高病害的防治效果。因此，创制新型杀菌剂来有效防治番茄病害，是农业实践中建立番茄病害绿色防控体系最核心的控制策略。

谷氨酰胺转氨酶（Transglutaminase, TGase, EC2.3.2.13）是调控细胞内自噬/线粒体自噬以及外泌体形成的关键酶，参与菌丝生长发育、细胞重塑、以及亚细胞器的生物发生过程。TGase是蛋白平衡调节因子，能够靶向多种底物交联聚集，形成对蛋白降解具有高耐受性的e-(γ-Glu)-Lys(GL)共价键，促进mTORC1与ATG1/ULK1复合物结合，提高ATG1/ULK1和ATG13磷酸化水平，抑制自噬发生。半胱胺（Cysteamine）通过抑制TGase可恢复Beclin1蛋白表达水平，引起自噬增加。研究表明，病原真菌细胞内TGase能够诱导宿主植物超敏反应和被侵染细胞自噬死亡，来对抗宿主以促进有效地侵染，抑制TGase是激活自噬和抑制蛋白质聚集的关键。通过靶向抑制TGase来限制灰霉菌体内蛋白质聚集，从而降低病原菌毒力和控制病害发生，为灰霉病防治提供了非常有前景的新思路。

麦角甾醇是真菌细胞膜上主要的甾醇成分，是细胞进行生长分裂所必需的，也是目前用于治疗侵袭性真菌感染的杀菌剂的主要靶点。甾醇14α-去甲基化酶（CYP51）是麦角甾醇生物合成途径中的关键限速酶，围绕该酶去开发杀菌药物，在临床和农业实践中非常成功，已获得最广泛的杀菌药物，在病原真菌侵染过程中表现出显著的治疗效果，根据含氮基团的种类不同可将其分为咪唑类和三唑类。该类药物通过干扰真菌细胞色素 P450 依赖酶的甾醇 14a-去甲基化酶CYP51，导致真菌细胞膜中甾醇中间体的积累和麦角甾醇的消耗，从而发挥杀菌作用。由于作用位点单一，灰霉病菌极易对三唑类杀菌剂产生抗药性，且田间已经出现了广泛的抗性菌株，农业领域亟需三唑类杀菌剂的新型替代药剂，来降低病原菌的抗性选择压力。

基于文献调研和前期研究成果，本项目将以谷氨酰胺转氨酶（TGase）和甾醇14α-去甲基化酶（CYP51）为作用靶点，开展新型杀菌剂的构效关系研究，通过构建基于TGase抑制剂和 CYP51 抑制剂的药效团模型，选择恰当的有机活性片段进行匹配连接，以此阐明目标化合物药效团模型的可靠性。通过对TGase抑制剂和 CYP51 抑制剂的结构特征分析，基于双靶点特征，进一步分析该类化合物具有双靶点协同抑制作用。选择已报道的具有杀菌活性的目标化合物，通过提取活性片段的方式构建杀菌片段库，经由虚拟片段筛选途径优选出双靶点各关键活性区域的结合片段，再以片段组合连接的方式高效构建出新型双靶点杀菌剂先导结构，为后续双靶点杀菌剂的设计与开发奠定基础，也为灰霉病的绿色防控提供高效手段。

一、使用Discovery Studio软件运用Lipinski类药五原则等对ChemDiv数据库的化合物进行类药性筛选。

传统新药研究通常采用高通量筛选（HTS）的方法，该方法是通过筛选庞大的化合物数据库得到先导化合物。这种方法虽然能够筛选出既定靶点的候选化合物，但面对全新或者复杂的靶点时该类方法成功率较低，得到的化合物常会出现假阳性的问题。基于这种背景下，基于片段的药物设计（FBDD）方法应运而生。该方法是通过从少量的片段化合物库中筛选出与靶蛋白结合能较低的活性片段，然后将其组合或延伸得到高活性的新化合物分子。与HTS相比，该方法更够准确地应用于各类复杂靶点的药物设计，具有高效、专一性强、类药性高等优点。利用FBDD方法发现新化合物分子具有几个重要的步骤。首先是片段化合物库的建立，其应符合“三原则”，分子量小于300，氢键供体和受体小于或等于3，脂水分配系数小于或等于3，然后筛选出有活性的分子片段。

二、构建基于TGase和 CYP51受体结构的共同药效团模型。并选择恰当的有机片段进行匹配连接，指导设计、合成目标化合物。

药效团模型作为一类代表性的CADD药物设计方法，可以将相应抑制剂的共同特征以三维结构要素的形式表达出来，其药效团直接反映了该类抑制剂的共同关键特征。因此，可以将其用来指导新型目标化合物的设计与发现。我们预期构建TGase和CYP51的药效团模型。通过分析相应药效团的结构特征，选择恰当的有机活性片段进行匹配连接，以此设计合成多个目标化合物，并对其进行体外抗真菌活性测试、机制研究及成药性预测，以帮助我们更好的发现新型抗真菌抑制剂。 

 根据抑制剂和靶酶的相互作用模式，以及药效团特征，确定出两类抑制剂的核心区域，以前期发现的抗真菌化合物为先导，采用核心区域基团替换的方式设计芳酰胺类化合物及其衍生物，以实现双靶点抑制剂的融合与共通，进而发挥协同抑制作用

具有不同共结晶配体的CYP51蛋白的晶体结构 

三、对剩下的分子进行进一步的生化评价，得到表现出良好的抑制效应和生物活力的分子。

从这些分子的二维结构出发，采用结构相似性搜索的方法筛选作用于功能蛋白的苗头化合物。将这些层层筛选后的分子的骨架在 ChemDiv数据库中进行衍生物搜索，得到含有相同骨架的化合物。将这些化合物通过对接评分和视觉检查进一步过滤，最终保留合格的化合物进行生物活性检测，判断在衍生物中是否有表现出强烈的抑制效果的分子。随后通过实验验证得到的化合物及其衍生物的选择性抑制效应。

1、 杀菌剂的研发主要分为四个板块，苯并咪唑类（MBCs）、二甲酰亚胺类（DCFs）、苯胺基嘧啶类（APs）、线粒体复合物III抑制剂（QoIs）和琥珀酸脱氢酶抑制剂（SDHIs）。这四种杀菌剂中最高效的就是针对细胞膜表面蛋白质靶点类的杀菌剂，因为这种杀菌剂可以直接针对真菌细胞膜起到干扰破坏作用。但是由于单作用位点杀菌剂的频繁使用，在我国山西、天津、辽宁、河南、上海等番茄种植地区均已发现灰霉病菌对多菌灵、腐霉利、嘧霉胺、氟吡菌酰胺、嘧菌酯、啶酰菌胺等多种杀菌剂产生了不同程度抗性。

本项目在抑制蛋白质功能的基础上，为了应对基因突变的可能性，创新性靶向两个功能蛋白，以应对单靶标药物针对的病菌可能因为基因突变而产生耐药性的情况。

2、通过计算机Discovery Studio、Schrodinger、PyMOL 3D软件辅助设计化合物给出针对TGase和CYP51蛋白的构效关系。TGase在灰葡萄孢菌中的作用是催化细胞膜蛋白质之间的交联，这种交联反应通过氨基酸残基间的共价结合形成细胞防御，关闭药物进入细胞的通道。甾醇是构成细胞膜的重要组分，在细胞膜结构、流动性以及膜蛋白的功能中发挥着重要作用，CYP51蛋白负责甾醇合成过程中的去甲基化。通过计算机辅助手段设计化合物靶向这两个灰葡萄孢菌细胞膜上的重要功能蛋白，可以高效杀死灰葡萄孢菌，在农业上大规模防治灰霉病。

3、采用基于结构的药物设计方法筛选潜在的TGase蛋白、CYP51蛋白抑制剂，设计发现活性较好的活性化合物，虚拟筛选得到苗头化合物有助于新型谷氨酰胺转氨酶、14α-甾醇脱甲基酶抑制剂的研发，为灰葡萄孢菌杀菌剂的药物生长方向研究提供理论依据和途径。

借助Discovery Studio、Schrodinger、GROMACS、PyMOL 3D视图等用来分子建模、化学计算、分子对接的软件辅助，设计化合物针对灰霉菌的谷氨酰转氨酶、麦角甾醇14α-脱甲基酶的催化结构域进行分子对接的作用特征，绘制3D结构模型来解析抑制剂结构衍生的构效关系，研究化合物的杀菌活性，创造新型杀菌剂的先导药物

一、通过Discovery Studio软件对ChemDiv数据库的化合物进行类药性筛选。

二、构建基于TGase和CYP51受体结构的共同特征的药效团模型。并选择恰当的有机片段进行匹配连接，指导设计、合成目标化合物。

三、对剩下的分子进行进一步的生化评价，得到表现出良好的抑制效应和生物活力的分子。